ÖZET

Toll benzeri reseptörler (toll-like receptors, TLR) doğal immün sistemin patojenler ile ilk karşılaşma aşamasında kilit rol oynayan protein yapılardır. Bu reseptörler sayesinde doğal immün sistem patojenlerin yapısını tanır ve inflamatuar yanıtı başlatır. Bu reseptörler aynı zamanda doğal immün sistem ile edinilmiş immün sistem arasında da köprü görevi görürler. TLR’lerden özellikle TLR2 ve TLR4’ün sepsis patogenezinde önemli görev üstlendikleri bilinmektedir. Bu reseptörlerin hücre içi inflamatuar sinyal yolaklarını harekete geçirme mekanizmaları ile ilgili bilgiler arttıkça bu yolakların modülasyonu önemli bir tedavi hedefi haline gelmiştir. Son yıllarda TLR’lerin enfeksiyöz olaylar dışında yoğun bakım hastalarını sıklıkla ilgilendiren iskemi reperfüzyon hasarı ve travma gibi enfeksiyöz olmayan olaylarda da önemli görev oynadıkları gösterilmiştir. TLR2 ve TLR4’ün ısı şok proteinleri ve serbest oksijen radikalleri tarafından da aktive olabildikleri ve bu aktivasyon mekanizmasının enfeksiyöz mekanizmalardan farklı olduğu da ortaya konmuştur. Bu derlemede TLR’lerin enfeksiyöz ve enfeksiyöz olmayan aktivasyonları ve hücre içi yolakları ile ilgili bilgi verildikten sonra yoğun bakım hastalarını sıklıkla ilgilendiren bazı özel durumlarda bu reseptörlerin üstlendikleri rol ve olası gelecek tedavi yaklaşımlarına değinilecektir. (Türk Yo­ğun Ba­kım Der­neği Der­gi­si 2012; 10: 63-73)

Giriş

İmmün sistem, doğal ve edinilmiş olmak üzere iki ana bölümde incelenir. Evrim sırasında gelişen ve tüm hayvan ve bitki sınıflarında var olan doğal immünite patojenlerin tanınması için toll benzeri reseptörler (toll like receptors, TLR) ailesini kullanır. Toll genleri, protein yapısında olan TLR’leri kodlar. Toll geni ilk defa 1985’te Nobel ödüllü Christiane Nüsslein-Volhard, Eric Weischaus ve arkadaşları tarafından bir meyve sineği olan Drosophila melanogaster’de tanımlanmıştır. İlk olarak toll geninin bu sineklerin dorsal-ventral akslarının embriyogenezinde önemli rol oynadığı ortaya konulmuştur. Takip eden yıllarda bu genin memelilerde de var olduğu ve hem memeliler hem omurgasızlarda doğal immünite için gerekli olduğu anlaşılmıştır. Bu gen ve reseptör ailesinin adı 1985’te bu geni ilk bulan ekipten olan Nüsslein-Volhard’ın meyve sineği larvasının dorsal vücut bölümüne göre az gelişmiş olan ventral bölgesini fark ettiğinde hayretini dile getirmek için söylediği “Das ist ja toll” cümlesinden gelmektedir. Almanca’da toll “inanılmaz” veya “harika” demektir.

TLR’ler doğal immünitenin parçaları olan makrofaj ve dendritik hücreler tarafından eksprese edilen tip 1 transmembran proteinleridir. Bu reseptörler ligandların tanımasından sorumlu ekstraselüler bölüm, transmembran heliks bölümü ve sinyal yolaklarının başlangıcı olan intraselüler toll-like/interlökin-1 reseptör (TIR) bölümü olmak üzere 3 bölümden oluşmaktadır. İnsanlarda TLR ilk Nomura ve arkadaşları tarafından 1994’te tanımlanmıştır. Ancak o zaman meyve sineğindeki toll’ün immün sistemdeki rolü bilinmediğinden bu reseptörün memelilerin gelişiminde rol oynadığı düşünülmüştür (1,2). TLR’ün insanlarda edinilmiş immün sistemi de harekete geçirebileceği 1997’de Janeway ve Medzhitov tarafından gösterilmiştir (3). TLR4’ün lipopolisakkaritleri algılayan bir reseptör olarak işlev gördüğünü gösteren Dr. Beutler ve Dr. Hoffmann 2011’de bu keşifleri ile Nobel ödülüne layık görülmüştürler. Günümüzde insanlarda 12 adet fonksiyonel TLR ve bu reseptörler için birçok ligand tanımlanmıştır. TLR 1, 2, 4, 5, 6 ve 10 çoğunlukla hücre yüzeyinde lokalize olup patojenlere spesifik moleküleri tanırlar. TLR 3, 7, 8 ve 9 ise intraselüler organellerin içinde lokalize olurlar. TLR ilişkili sinyal yolaklarının uyarılması sonucunda interlökin (IL)-1, IL-6, tümör nekroz faktörü (TNF)-α ve diğer proinflamatuar sitokinlerin üretimi ile birlikte edinilmiş immün sistemin aktive olmasında rol oynayan “eş zamanlı uyarı (costimulatory) moleküllerinin” ekspresyonu da gerçekleşmiş olur. Böylece hem doğal hem de edinilmiş bağışıklık sistemleri aktive edilmiş olur.

TLR’ler immün savunma sisteminin ilk basamağında rol oynarlar. Patojenlerde konakta bulunmayan ve “patojen ilişkili moleküler kalıplar” (pathogen associated molecular patterns, PAMPs) olarak adlandırılan bileşenler bulunmaktadır (4). Enfeksiyon sırasında makrofajlar PAMPs’ı TLR’ler aracılığı ile tanırlar. TLR sinyal mekanizması ile proinflamatuar sitokin ve nitrik oksit gibi antimikrobiyal küçük moleküllerin üretimi indüklenir ve makrofaj aktivasyonu ortaya çıkar. Böylece enfeksiyonun erken aşamasında makrofajlar mikroorganizmaların eliminasyonu için aktive olurlar. Ancak doğal immün sistem aktivasyonunun patojenlerin yok edilmesinde sınırlı rolü vardır. Edinilmiş immün sistem aktivasyonu ile daha efektif bir konak yanıtı oluşur. TLR’lerin uyarılması sonucunda, perifer dokular ile lenfoid dokular arasındaki iletişimi sağlayan dendritik hücre aktivasyonu başlar ve bu olayların sonucunda edinilmiş immün sistemin en önemli bileşeni olan T-hücre aktivasyonu gerçekleşir (5-10).

Başlangıçta, TLR’lerin bakteriyel ligandlar ile olan etkileşimleri ve enfeksiyon ve sepsisin hücresel aktivasyondaki rolleri tanımlanmıştır. Ancak son çalışmalarda, TLR ailesinden TLR2 ve TLR4‘ün PAMPs dışında belli endojen molekülleri de ligand olarak tanıyabildikleri gösterilmiştir. Bu ligandlar arasında “tehlike ilişkili moleküler kalıplar” (danger associated molecular patterns, DAMP) ve inflame dokudaki diğer moleküller de yer almaktadır. Örneğin farelerde ısı şok proteini 60 (Hsp60) ile TLR4 üzerinden inflamasyonun tetiklendiği gösterilmiştir (11). TLR’ler için tanımlanan PAMPs ve PAMPs-olmayan ligandlar sadece TLR aktivasyonu ve konak savunma yanıtı için değil, çeşitli inflamatuar süreçlerin oluşmasında da önemli rol oynarlar. Son hayvan çalışmalarında, kanama ve iskemi/reperfüzyon hasarı gibi bakteriyel olmayan olaylarda da TLR2 ve TLR4 aktivasyonunun, önemli rol oynadığı gösterilmiştir (Tablo 1).

1998’de TLR4-mutant farelerde lipopolisakkarite (LPS) karşı yanıtların yetersiz olduğu genetik analizlerle gösterilmiştir (12,13). Leptospira ve Porfiromonas’a ait LPS’in TLR2 yoluyla inflamatuar yanıta neden olurken, gram negatif bakterilerin LPS’inin genel olarak TLR4 yoluyla inflamatuar yanıtı başlattığı kabul edilmektedir (14,15). Gram pozitif bakterilerin hücre duvarında bulunan peptidoglikan (PGN), LPS ile oluşan immün yanıta benzer reaksiyonlar ortaya çıkarır. TLR2-mutant farelerde, PGN’a karşı yanıt oluşturmak için TLR2’nin gerekli olduğu gösterilmiştir (16). TLR2 aynı zamanda Mycoplasma, Mycobacteria ve Neisseria’lar gibi diğer mikroorganizmalara ait ligandlar yoluyla da aktive olabilmektedir (17,18). TLR2’nin bu kadar çok çeşitli PAMP’ı tanıyabilmesinin sebebi, diğer TLR’ler ile oluşturabildiği heterodimerlerdir (TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 gibi).

Yoğun bakımda sepsis başta olmak üzere birçok olayda TLR’lerin öneminin anlaşılması ile bu reseptörler hem ilgi gören bir araştırma konusu hem de önemli bir tedavi hedefi haline gelmiştir. Bir anti-TLR4 olan eritoran ile sepsisli hastalarda gerçekleştirilen çok merkezli ACCESS çalışması bu saptamanın en önemli kanıtlarındandır (www.clinicaltrials.gov, NCT00334828). Bu derlemede TLR’ler ile ilgili temel bilgilere yer verilerek bu konuya ilgi duyanlar için bir başlangıç kaynağı oluşturulması amaçlandı.
TLR4 ve Lipopolisakkaritler (Şekil 1)

LPS’ler, gram negatif bakterilerin dış membranında bulunan PAMPs’dır. LPS’lerin 3 parçası vardır: Lipid A, oligosakkarit çekirdek ve distal polisakkarit (O antijeni) (19). Hücre yüzeyine gömülü olan Lipid A parçası, tek başına doğal immün sistemi aktive etmede yeterlidir. Lipid A, IL-12 ve nitrik oksit gibi moleküllerin üretimini indükler. Yeterli miktardaki LPS, klinik olarak hayatı tehdit eden endotoksemiye sebep olabilir. CD14 adı verilen, LPS’i hücre yüzeyinde tutan bir glikozilfosfatidilinositol (GPI) protein tanımlanmıştır. Lipid A’nın CD14’e bağlanması ile in vivo olarak septik şok sendromunun ortaya çıktığı gösterilmiştir (20,21).

TLR’ler, kendi ligandları ile etkileşerek sinyal transdüksiyon kaskadını aktive eder ve sonuçta immün yanıttan sorumlu genlerin ekspresyonunu sağlarlar. TLR’lerin ligandlarını tanıması her zaman onlara doğrudan bağlanmak şeklinde olmamaktadır. TLR4 diğer TLR’lerden farklı olarak ligandlarına doğrudan bağlanmaz. TLR4 ile ekspresyonu gerçekleşen MD2 adı verilen molekül, TLR4’ün ekstraselüler kısmı ile bağlanarak, TLR4’ün ligandları ile etkileşime girmesini kolaylaştırır (22,23). TLR2 ve TLR4’ün kendi ligandları ile etkileşimi hücresel aktivasyona neden olur. Bu aktivasyon “myeloid differentiation primary response gene” (MyD88) ve MyD88 adapter-like (Mal) moleküllerini içeren ortak bir yolak ile ortaya çıkar.

Aksesuar moleküller olan lipid bağlayıcı protein (LBP) ve CD14, LPS’leri bakteri membranından ayırarak, ligandın MD2’ye transferini sağlarlar. TLR’lerin intraselüler kısmı IL-1 resptörünün (IL-1R) intraselüler kısmına benzerlik göstermektedir. Bu sebeple Toll-like/interlökin 1 reseptör (TIR) olarak isimlendirilmiştir (24). TLR’ün ekstraselüler kısmının aktivasyonu, TIR dimerizasyonuna neden olur ve MyD88, Mal, TIR ilişkili yapı iskeleti proteinlerinden olan IFN-β (TRIF) ve TRIF ilişkili adaptör molekülün (TRAM) bağlanması için konformasyonel değişiklikler olur. Bu komplekslerin bir araya gelmesi ile sinyal yolakları aktive olur ve IL-1R-ilişkili kinaz (IRAK) fosforilasyonu ve TNF-reseptör ilişkili faktör 6 (TRAF6) aktivasyonu gerçekleşir. TRAF6 aktivasyonu, NF-κβ ilişkili kinazın (NIK) ve I-κβ kinaz (IKK) aktivasyonuna neden olur. Bu olayların sonucunda NF-κβ’nin nükleusa translokasyonu gerçekleşir ve κβ bağımlı genler aktive olur. Bu genler arasında proinflamatuar sitokinler ile inflamatuar ve immün yanıtların diğer mediatörleri ile beraber edinilmiş immün sistemin aktivasyonunu sağlayan “eş zamanlı uyarı (costimulatory) moleküllerinin” gen ekspresyonu da yer almaktadır (1-4). Böylece edinilmiş bağışıklığın aktivasyonu sağlanmış olur. TLR4’ün aşırı ekspresyonu sonucu NF-κβ aktivasyonu ve sitokin üretimi artar.

TLR2 ve TLR4 tarafından aktive edilen sinyal yolakları ile ilgili son çalışmalara ek olarak, TLR2 ve TLR4 ile aksesuar moleküllerin ve bunların ligandları ve antagonistleri arasındaki moleküler etkileşimleri de anlaşılmaya çalışılmaktadır.

Bir sitoplazmik protein olan MyD88, tüm IL-1R ve TLR ailesi ile etkileşime geçebilir ve TLR ailesinin sinyal mekanizması için MyD88’in gerekli olduğu gösterilmiştir (25-28). MyD88, IL-1R-ilişkili kinaz (IRAK) ve TNF-reseptör ilişkili faktör 6 (TRAF6) arasında oluşan kompleks sonucu NF-κβ ve mitojenle aktive olan protein kinaz (MAPK) kaskadı aktive olur (26,29). Ancak MyD88 olmayan farelerde, LPS ile ortaya çıkan NF-κβ ve MAPK kaskadı aktivasyonunun geç başlaması, TLR4’ün bu kaskadları aktive etmede MyD88’den bağımsız bir şekilde de hareket edebildiğini göstermektedir (30). MyD88 eksik olan makrofajlarda, LPS’e karşı oluşan sitokin yanıtının bozulmasına rağmen, NF-κβ aktivasyonu korunmaktadır. Bunun yanında MyD88 eksik olan farelerde nitrik oksit üretimi, B hücre formasyonu ve endotoksemik şok yanıtı da bozulmuş olur (30). TLR4 ve MyD88 eksik olan dendritik hücrelerde de sitokin üretimi bozulmuş olur. Ancak kostimülator moleküllerin ekspresyonu MyD88 eksik olan farelerde korunmuştur. Tüm bu veriler TLR4’ün hem MyD88 bağımlı hem de MyD88 bağımsız yolaklarda önemli rol oynadığını göstermektedir. IRAK aktivasyonu MyD88 bağımsız yolakta bozulmuştur. IRAK aktivasyonu olmayan durumlarda da NF-κβ ve MAPK kaskadlarında gecikmiş aktivasyon söz konusudur (31). TRAF6 eksik olan embriyonik fibroblastlarda da bozulmuş ancak saptanabilir miktarlarda NF-κβ aktivasyonu gecikmiş olarak ortaya çıkabilmektedir.

LPS sinyal transdüksiyon kaskadında yer alan moleküller, sepsisin önlenmesi ve tedavisinde potansiyal hedef moleküllerdir. TLR antagonistleri ile zararlı proinflamatuar sitokinlerin etkileri azaltılabilir. TLR2 ve TLR4 inhibisyonu, kritik hastalıkta klinikte kullanılmak üzere olası terapötik yaklaşımlar sağlamıştır. Sepsis ve septik şok tedavisi için, Lipid A’nın bir çok sentetik türevi üretilmiştir. Eritoran (E5564), Rhodobacter sphaeroides’in patojenik olmayan LPS’sinin bir komponenti olan Lipid A’nın sentetik bir türevidir. Bu bileşik, TLR4-MD2 kompleksinin antagonisti olarak rol oynamaktadır ve faz 3 klinik çalışması devam etmektedir (32,33). TLR2 ve TLR4’ün non-septik akut organ hasarındaki potansiyel rolleri ve non-bakteriyel koşullarda, TLR2 ve TLR4 ilişkili hücresel aktivasyonun inhibisyonunun kritik hastalıkta sonuçları iyileştirmesinin potansiyel yeri de son çalışmalarda incelenmeye başlanmıştır.

TLR2 ve TLR4’ün sinyal yolakları (Şekil 1)

TLR2/TLR1 veya TLR2/TLR6 heterodimerinin veya TLR4 homodimerinin ligandları ile etkileşimi intraselüler sinyal yolaklarının aktivasyonuna neden olur. Burada toll benzeri/interlökin 1 reseptör (TIR), MyD88 ve “MyD88 adapter like” (Mal) moleküllerinin etkileşimi ve lκBα kinaz (IKK) kompleksinin aktivasyonu sonucunda 26S proteozomda bulunan NF-κB inhibitörü lκBα parçalanır (34-36). lκBα sitoplazmik konsantrasyonlarının azalması ile NF-κB sitoplazmadan nükleusa girerek, κB bağımlı genleri aktive eder. Bu genler arasında proinflamatuar sitokinler ve inflamatuar ve immün yanıtların diğer mediatörleri yer almaktadır (34-37).

TLR2 ve TLR4’ün kendi ligandları ile etkileşimi hücresel aktivasyona neden olur. Bu aktivasyon myeloid differentiation primary response gene–88 (MyD88) ve MyD88 adapter-like (Mal) moleküllerini içeren ortak bir yolak ile ortaya çıkar (34). TLR4 ilişkili mekanizma, alternatif bir yol ile de oluşabilir. Bu yolda Toll/IL-1 reseptör (TIR) birimi, diğer TIR ilişkili yapı iskelesi proteinlerinden olan IFN-β (TRIF) ve TRIF ilişkili adaptör molekül (TRAM) indüksiyonu yapar ve bu da interferon düzenleyici faktör 3 (interferon regulatory factor 3, IRF3) dimerizasyonu ve aktivasyonuna neden olur. Sonuç olarak interferon-γ gibi IRF-3 bağımlı genlerin transkripsiyonu gerçekleşir (34,38) (Şekil 1).

CD14, TLR spesifik ligandlardan olan peptidoglikan veya lipoteikoik asitlerin TLR2’ye ve LPS’lerin TLR4’e bağlanmasını sağlayarak TLR2 ve TLR4 aktivasyonunu kolaylaştırır (Şekil 1). TLR4 tek başına hücrelerin LPS’e olan yanıtından sorumlu değildir. Bunun için MD2 adında TLR4 ile kompleks oluşturan ek bir proteine ihtiyaç vardır (23). Hayvan çalışmalarında MD2 mutant farelerde LPS’e yanıt oluşmadığı ve endotoksemi ilişkili mortaliteden korundukları gösterilmiştir (39).

İskemi-Reperfüzyon Hasarında TLR2 ve TLR4

İnme, miyokard enfarktüsü ve solid organ transplantasyonunda ortaya çıkan iskemi reperfüzyon hasarının TLR2 ve TLR4 üzerinden artabileceği ile ilgili kanıtlar giderek artmaktadır. TLR4 veya TLR4 ilişkili yapısal iskelet proteini MyD88 eksikliği olan transgenik farelerde, hemoraji, miyokard enfarktüsü veya böbrek iskemi reperfüzyon hasarını takiben gelişen organ disfonksiyonlarının azaldığı in vivo olarak gösterilmiştir (Tablo 1) (40-42). Bu inflamasyon modellerinde, dolaşımda LPS yer almamakta ve LPS’in TLR4 aktivasyonuna neden olduğuna dair kanıt da bulunmamaktadır. Örneğin, TLR4’ün nötrofil aktivasyonu, akciğerde artmış TNF-α konsantrasyonları ve dolaşımda ksantin oksidaz seviyelerinin artması ve reaktif oksijen radikallerinin artmış üretimi ile ilişkili olarak ortaya çıkan kanamaya sekonder akut akciğer hasarı gelişiminde anahtar reseptör olduğu gösterilmiştir (40). Buna benzer olarak, kanama ve resüsitasyonu takiben ortaya çıkan mezenterik endotelyal disfonksiyonda da TLR4’ün yeri olduğu gösterilmiştir (43). Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, nonfonksiyonel TLR4’ü olan C3H/HeJ farelerde koroner ligasyon sonrası enfarkt alanı daha küçük bulunmuştur. Bu bulguya dayanarak TLR4’ün miyokard iskemisi ile ortaya çıkan hücresel sinyallerin aktivasyonunun transdüksiyonu için gerekli olduğu ortaya konmuştur (41).

Benzer şekilde, TLR2 yokluğunda, sol ön inen koroner arterin bağlandığı kardiyak iskemi reperfüzyon modelinde, daha küçük enfarkt alanı ve azalmış endotel disfonksiyonu ile lökosit infiltrasyonu olduğu gösterilmiştir (44). TLR2, TLR4 ve MyD88 renal iskemi reperfüzyona bağlı renal disfonksiyona da katkıda bulunurlar (42,45-47).

Süperoksit gibi oksijen radikalleri, akut inflamatuar yanıtların başlatılması ve artmasında rol oynarlar (48-50). In vivo çalışmalarda, süperoksit üretiminin proinflamatuar olduğu gösterilmiştir. Örneğin, süperoksit dismutaz inhibisyonu veya ksantin oksidaz ile süperoksitin aşırı üretimi sonucu çok daha ciddi kanama ilişkili organ disfonksiyonları gösterilmiştir (51,52). Bunun tersine, süperoksit dismutazın aşırı üretimi nedeniyle, süperoksitin ortamda bulunmaması farelerde, kanama veya diğer iskemik olaylarla ilişkili organ disfonksiyonlarında daha iyi sonuçlar doğurmuştur (53,54).

İskemi reperfüzyon hasarında ksantin oksidaz ve NADPH oksidaz ekstraselüler süperoksitin önemli kaynaklarıdır. Ksnatin oksidaz ile ortaya çıkan ekstraselüler süperoksitin nötrofilleri aktive ettiği ve indüklenen nötrofil ilişkili proinflamatuar yanıtın TLR4 bağımlı mekanizmalarla ortaya çıktığı gösterilmiştir (55). Ksantin oksidazın süperoksit oluşumundaki katalitik aktivitesi, TLR4 ilişkili sinyal yolaklarının ve proinflamatuar yanıtların aktive olması için gereklidir (55). Buna göre ksantin oksidaz ve NADPH oksidaza göre süperoksitin proinflamatuar yanıtlar için majör bir mediatör olduğu söylenebilir. Ksantin oksidazın TLR4’e bağlanabildiği ve süperoksitin nötrofilleri aktive etmesi için ksantin oksidaz tarafından hemen TLR4 komşuluğunda oluşması gerektiği gösterilmiştir (55). Benzer olarak, NADPH alt grubu olan NOX4 (gp 47phox) TLR4’e bağlanabilir ve NOX2 (gp91phox) ise TRL2 ile ilişkilidir (56,57).

Ekstraselüler süperoksitin TLR4 üzerinden indüklediği hücresel aktivasyonun kesin mekanizması henüz tam olarak bilinmemektedir. İntraselüler sinyal yolaklarının başlaması için gerekli olan TLR4 dimerizasyonunu direkt olarak sağlayabilmek ile beraber, süperoksit TLR4 ilişkili sinyal yolaklarını indirekt olarak da etkileyebilir. Örneğin, indüklenebilir nitrik oksit sentazın (iNOS) artmış aktivasyonu ve bunun sonucunda açığa çıkan nitrik oksit, septik şok ve diğer kritik hastalık süreçlerinde söz konusudur (58). Çünkü süperoksit NO ile etkileşime girerek, peroksinitrit oluşturur. TLR4 ve peroksinitrit arasındaki etkileşimler ile de süperoksitin TLR4 ile direkt ilişkisi söz konusu olmadan da hücresel aktivasyon indüklenmiş olur.

Süperoksit dışındaki diğer reaktif oksijen radikalleri de TLR4 bağlı mekanizmalar ile inflamatuar süreçleri düzenler. Örneğin süperoksitin dismutasyonu ile oluşan hidrojen peroksitin hemorajik şokta, TLR4’ün membran lipidlerindeki lokalizasyonunu artırdığı gösterilmiştir (59). Son çalışmalarda, hiperoksi veya intestinal iskemi reperfüzyon ile ortaya çıkan akut akciğer hasarında, inflamasyonun TLR3 bağımlı olduğunun gösterilmesi ile beraber, diğer TLR’lerin de ROS ilişkili inflamasyonda önemli olabileceği düşünülmektedir (60,61).

Travmada TLR2 ve TLR4

Travma sonrası kanama ilişkili sistemik veya bölgesel hipoperfüzyona bağlı doku hasarı, nekrotik hücrelerden endojen TLR4 ligandlarının (DAMPs) salıverilmesini indükler. Bu endojen nonbakteriyel mediatörler ile etkileşim sonucu TLR4’ün aktivasyonu inflamasyona ve akut akciğer hasarı ve diğer organ hasarlarının gelişimine katkıda bulunur.

Hemoglobinin yapısında bulunan hem, TLR4’ü LPS’in kullandığından farklı bir mekanizma ile aktive edebilir. Hemoliz veya yaygın doku hasarı ile ilişkili olan patofizyolojik durumlarda dolaşımda yüksek miktarda serbest hem ortaya çıkar. Örneğin travma, iskemi reperfüzyon hasarı, hemoglobinopatiler, hematomlar, kanama veya kas hasarı sonucu oluşan rabdomiyoliz ile dolaşımda artmış miktarda serbest hem ve hem ilişkili moleküller bulunur (62,63). Artmış hem, ROS’un artmış üretimi ile ilişkilidir (64). Makrofajların hem ile karşılaşması sonucu, MyD88, CD14 ve TLR4 aracılı mekanizmalar ile proinflamatuar sitokinler ve tümör nekroz faktör-α’nın (TNF-α) artmış üretimi söz konusu olur (65). TLR4’ün hem ile aktive olabilmesi için demir ve porfirin halkasının vinil gruplarına ihtiyaç vardır (65).

Hem ile ortaya çıkan TLR4 ilişkili sinyal yolaklarının aktivasyonu, TLR4/MD2 ve LPS arasındaki etkileşim mekanizmalarından farklı bir mekanizma ile ortaya çıkmaktadır. Çünkü antiTLR4/MD2 antikorları LPS ilişkili TNF-α sekresyonunu inhibe eder ama makrofaj-hem etkileşimi ile ortaya çıkan TNF-α sekresyonunu etkilemez (Tablo 1) (65).

Ekstraselüler matriksin majör glikozaminoglikanlarından olan hiyalüronik asitin (HA), inflamasyon ve doku hasarında küçük parçalar halinde ortamda bulunduğu gösterilmiştir (66,67). Yüksek molekül ağırlıklı HA (2-6x106 Da) in vivo hiyaluronidaz β-glukuronidaz ve heksozaminidaz ile polimerize olduğunda küçük molekül ağırlıklı (0.2x106 Da) parçalara dönüşebilir. Travma sonrası ekstraselüler matriksten bu küçük molekül ağırlıklı HA parçalarının salıverildiği gösterilmiştir (68). In vivo olarak küçük molekül ağırlıklı HA’nın aktif inflamatuar olaylarla ilişkisinin gösterilmesinin yanında, aynı zamanda HA klirensinin CD44 bağımlı olarak azalması da akciğerde inflamasyon ve hasara katkıda bulunur (Tablo 1) (69-71). Düşük molekül ağırlıklı HA fragmanlarının, makrofajlardan inflamatuar sitokinlerin üretimi için MD2, MyD88, TLR2 ve TLR4’e ihtiyaç duydukları fare çalışmalarında gösterilmiştir (66,72).

Düşük molekül ağırlıklı HA fragmanları TLR4 ilişkili sinyal yolak aktivasyonunu LPS ilişkili mekanizmalardan farklı olarak gerçekleştirir. TLR4 ilişkili sinyal yolak aktivasyonu için, düşük molekül ağırlıklı HA fragmanları MD2’ye ihtiyaç duyarken CD14’e ihtiyaç duymazlar (Tablo1). Düşük molekül ağırlıklı HA fragmanları hücre membranında, TLR4 ve CD44 arasında etkileşime neden olarak sinyal yolaklarının aktivasyonuna neden olur (68). Ayrıca HA fragmanları ile gerçekleşen monositlerdeki gen aktivasyonunun da LPS etkileşimi sonrası ortaya çıkandan farklı olduğu gösterilmiştir (Tablo 1) (68). NF-κB bağımlı moleküllerden TNF-α, MIP-2 ve monocyte chemottractant protein 1 (MCP-1) gibi bazı moleküller HA ve LPS tarafından benzer şekilde eksprese olurken granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) ve IL-1α gibi diğer moleküller ise LPS’e göre HA ile farklı şekilde eksprese olurlar (68). Bu bulgular, steril TLR4 aktivasyonundaki gen ekspresyonunun sepsisteki TLR aktivasyonununkinden farklı olduğunu göstermektedir.

Geç İnflamasyonda TLR4

TLR4, high mobility group box-1 protein’in (HMGB1) katkıda bulunduğu geç inflamatuar yanıta da katkıda bulunur. Nükleer nonhiston DNA bağlayıcı protein olarak tanımlanan HMGB1, özellikle IL-1β, LPS veya DNA gibi proinflamatuar mediatörlere bağlandığında ekstraselüler inflamasyonda rol oynar (73-76). Farelerde endotoksinle karşılaşmadan sonra, geç dönemde serumda HMGB1 seviyelerinin arttığı gösterilmiştir (73,77). İnsanlarda travmadan 6 saat sonra HMGB1 seviyelerinin arttığı gösterilmiştir (78). HMGB1’in proinflamatuar etkileri farelerde intratrakeal enjeksiyonu sonrası akut akciğer hasarı geliştirmesi ile gösterilmiştir (79). Tedavide gecikme olmasına rağmen ve erken proinflamatuar yanıtların ortaya çıkmasından sonra verildiğinde antiHMGB1 antikorlarının farelerde LPS ile indüklenmiş mortaliteyi azalttığı gösterilmiştir (73). LPS’in indüklediği akut akciğer hasarı modelinde anti-HMGB1 verilmesi ile IL-1β ve TNF-α gibi proinflamatuar sitokinlerin akciğer konsantrasyonları değişmezken akciğer hasarının ciddiyeti azalmıştır (79). Benzer olarak, peritoniti olan septik farelerde, çekal ligasyon perforasyonuna bağlı enfeksiyonun başlangıcından sonraki 24 saat içinde anti-HMGB1 antikorları verildiğinde mortalitenin azaltılabildiği gösterilmiştir (80).

Geçici transfeksiyon yapılan immortalize insan embriyonik böbrek 293 hücrelerinde HMGB1’in TLR2 ve TLR4 üzerinden hücresel aktivasyon ve NF-κB bağımlı transkripsiyonu indüklediği gösterilmiştir (81). Çalışmalarda HMGB1’in TLR4’ten başka TLR2 ile olan etkileşimleri de gösterilmiştir. HMGB1’in TLR2 ve TLR4 ile olan etkileşimleri, HMGB1’in LPS ile ortaya çıkan hücresel aktivasyona ve inflamatuar yanıtlarına benzer etkilerini açıklayabilmektedir (81). Buna rağmen, HMGB1’in kendisinin proinflamatuar etkisi yoktur. Sitokin üretimini makrofajlar ve diğer hücrelerde DNA’ya bağlandıktan sonra ve IL-1 β gibi proinflamatuar sitokinler yoluyla gerçekleştirir (Tablo 1) (75). Bu bulgular HMGB1 ile TLR2 ve TLR4 arasındaki etkileşimlerin doğrudan değil, HMGB1’e bağlı kofaktörler aracılığı ile sağlandığını düşündürmektedir. Bu konuda yeni çalışmalara gereksinim vardır.

TLR2, TLR4 ve Heat Shock Proteinleri

Hsp60, Hsp70, Hsp72, Hsp90 ve gp96 gibi ısı şok protein (HSP) ailesinin üyeleri, CD14/TLR2 ve CD14/TLR4 reseptör kompleksleri aracılığı ile proinflamatuar sitokinlerin üretimini indükleyebilmektedirler (82). Hsp60, TLR2 üzerinden TNF-α ekspresyonunu indükler ve TNF-α ekspresyonunu TLR4 ve MD2 ile MyD88 ve TNF reseptor ilişkili faktör 6 (TRAF6) ile etkileşime girerek artırır (Tablo 1) (83). HSP’ler primer olarak olgunlaşmamış polipeptid zincirlerini ve kısmen katlanmış protein ara ürünlerini tanıyıp onlara bağlanırlar ve böylece bu tip proteinlerin agregasyonunu önleyen moleküler şaperonlar gibi rol oynarlar (84-86).

HSP’ler esas olarak patofizyolojik durumlarda artmış seviyelerde eksprese edilirler. Örneğin nekrotik hücre ölümü sonucu, HSP’ler ekstraselüler kompartımana sızarlar (87). Buna ek olarak, HSP’ler nekrotik hücre ölümünden bağımsız olarak iskemi reperfüzyon hasarı (82-88), travma (89) ve ağır egzersiz (90) gibi durumlarda ekstraselüler olarak da salıverilebilmektedirler. Buna rağmen, HSP’lerin TLR aracılı mekanizmalar ile hücre aktivasyonunu nasıl sağladığı tam olarak anlaşılamamıştır. HSP’ler ve TLR’ler arasındaki etkileşimlerin önemi tartışmalı bir konudur (91,92).

Son çalışmalarda HSP’lerin hücresel aktivasyon mekanizmasının incelenmesi için LPS içermeyen rekombinan HSP’ler kullanılmıştır. Hücrelerin HSP’lere maruz kalması sonucu LPS ile gerçekleşen proinflamatuar sitokin ekspresyonundan farklı ve TLR4-bağımlı olan spesifik bir düzen oluştuğu gösterilmiştir. Örneğin, hepatik iskemi reperfüzyonda hücreler tarafından Hsp72 salıverildiği gösterilmiştir (93). Bu hepatositlerin saflaştırılmış insan rekombinan Hsp72 ile uyarılması ile TNF-α veya IL-6 üretimi olmazken, MIP-2 üretiminde doz bağımlı artış gösterilmiştir. TLR-4 eksik olan farelerde, hepatositlerin MIP-2 üretimi belirgin olarak azalmıştır (93). Bir diğer çalışma ise, Hsp72’nin iskemi reperfüzyon hasarında TLR4 bağımlı bir mekanizma ile rol oynadığını ve rekombinan Hsp72 ile NF-κB aktivasyonunun gerçekleştiğini ve yine TLR4 bağımlı mekanizma ile TNF-α, IL-1β ve IL-6 ekspresyonlarının arttığını ve miyokardial kontraktilitenin deprese olduğunu göstermiştir (94).

Olası Tedavi Yaklaşımları

Giderek artan miktarda veri, TLR2 VE TLR4’ün kritik hastalıkla ilişkili deneysel düzeyde organ disfonksiyonuna neden olduğunu göstermektedir. Bunlar içinde sepsis, travma, hiperoksi ve iskemi reperfüzyon hasarı yer almaktadır. Ancak bazı temel sorular cevapsız kaldığından TLR2 veya TLR4 modülasyonu üzerinden etki gösterecek tedavi seçeneklerinin geliştirilmesi şu anda mümkün gözükmüyor. Artan sayıda nonmikrobiyal ligandın TLR2 ve TLR4 yoluyla hücresel aktivasyonu başlattığı gösterilmiştir. Çalışmalarda bu tip ligandların TLR2 ve TLR4 ile yaptığı komplekslerin yapısı ve bu etkileşimler ile indüklenen proinflamatuar sinyallerin en etkili şekilde durdurulması üzerinde durulmaktadır.

Hemoglobinin içindeki hem molekülünün TLR4 ile etkileşimi sonrası ortaya çıkan inflamasyon MD-2’den bağımsız iken hiyalüronik asitin küçük fragmanları ile oluşan inflamasyon ise CD14 bağımsızdır (Tablo 1). Bu tip bulgular TLR4 ve muhtemelen TLR2’nin, PAMP’lar tarafından kullanılan mekanizmalardan farklı şekillerde aktive olabildiklerini göstermektedir. Hücresel etkileşimin bu yolakları üzerine spesifik farmakolojik girişimler kritik hastalıklara yol açan patolojik inflamatuar süreçleri azaltırken, TLR2 ve TLR4’ün immün sistemdeki yararlı etkilerini değiştirmeyecektir. Septik olmayan TLR2 veya TLR4 bağımlı organ disfonksiyonu modülasyonunda etkili olabilecek terapötik stratejiler reseptör agonistleri, reseptör antagonistleri ve sinyal transdüksiyon inhibitörlerini içerir.

İskemi reperfüzyon veya travma ile TLR4’ün indüklediği organ disfonksiyonu arasındaki ilişki, TLR4 ilişkili hücresel aktivasyonun baskılanmasının klinik sonuçları iyileştirebileceğini düşündürtmektedir. TLR2 ve TLR4’ün rol oynadığı septik olmayan kritik hastalıklarda, TLR2 ve TLR4 ile indüklenen yolakların erken evrelerini hedef alan ligand spesifik girişimler tedavide faydalı olabilir. Örneğin TLR’lerin tanımlanmasından önce bile gram negatif sepsis ve endotoksemi tedavisinde lipid A antagonistleri geliştirilmekteydi. TLR4 aktivasyonunu inhibe eden ve bir lipid A analoğu olan E5564’ün (eritoran) günümüzde sepsis ile ilgili klinik çalışmalarda etkinliği araştırılmaktadır (32). Farelerde miyokardiyal iskemi reperfüzyon modelinde E5564 kullanımı, enfarkt boyutunu azaltmış ve transkripsiyonu NF-κB bağımlı olan proinflamatuar sitokinlerin üretimini de baskılamıştır (95). E5564 aynı zamanda TLR4 ile fibronektin EDA arasındaki etkileşimi de antagonize eder (96). Bu çalışmalar E5564’ün TLR4’ün rol oynadığı sepsis ve endotoksemi dışındaki diğer klinik durumlarda da kullanılabileceğini ortaya koymaktadır.

Lipid A analoglarına benzer şekilde, Lactobacillus plantarum lipoteikoik asit gibi lipoteik asit analogları da TLR2 ilişkili sinyal transdüksiyonunu inhibe eder. Lactobacillus plantarum lipoteikoik asit aynı zamanda Staphylococcus aureus ile karşılaşan hücrelerde TLR2 üzerinden ortaya çıkan TNF-α üretimini de bozmaktadır (97). Benzer şekilde TLR2 antagonisti olan yeni sentetik fosfolipidler sentezlenmiştir, ancak bunların kritik hastalıklarda kullanılmasına ilişkin deneysel çalışma verileri bulunmamaktadır (98). Spesifik peptidler, küçük moleküller veya antikorlar kullanarak ligand ve reseptör arasındaki ilişkinin bozulması, sinyal iletiminin ve hücresel aktivasyonun bozulması için klasik bir yoldur. Hücre membranı ve TLR4 ilişkisi ile ksantin oksidaz salıverilmesine neden olan heparinin, TLR4 ilişkili intraselüler sinyal mekanizmalarının süperoksit bağımlı aktivasyonunu azalttığı gösterilmiştir. Bu bulgular, heparinin, hemoraji veya intestinal iskemi gibi dolaşımda ve hücre içinde artmış miktarlarda bulunan ksantin oksidazın bulunduğu patofizyolojik durumlarda, inflamasyon ve organ disfonksiyonunu azalttığını göstermektedir. Heparinin, ksantin oksidaz ilişkili TLR4 aktivasyonunu azaltabilmesi, antikoagülan etkilerinden bağımsız olarak, heparinin sepsiste faydalı olabileceğini göstermektedir (55). Buna ek olarak, hücre yüzeyine ksantin oksidaz heparan sülfat zincirleri yoluyla bağlandığından, ksantin oksidazın glikozaminoglikanlara bağlandığı bölgeyi bloke eden peptidler, aynı zamanda TLR4 ile ksantin oksidaz arasındaki etkileşimi de bozabilmektedir. Bu tip peptidlerin potansiyel yararı, bakteriyel enfeksiyonlara karşı konak savunmasını bozmadan, ksantin oksidaz ilişkili süperoksitin proinflamatuar etkilerini bloke edebilmesidir. Benzer olarak, TLR4’ün TIR parçası ile NADPH oksidaz alt ünitelerinin etkileşimlerinin bloke edildiği spesifik tedaviler sonucunda, iskemi reperfüzyonda TLR4 bağımlı inflamasyonda azalma gerçekleşebilir. Hemoglobinin içindeki hem molekülü gibi MD-2 olmadan TLR4 ilişkili hücresel aktivasyonu aktive eden ligandlar, protoporfirin IX gibi küçük moleküller aracılığı ile TLR4’den ayrılabilmektedir. Böylece, enfeksiyona karşı yararlı immün yanıtları inhibe etmeden, proinflamatuar etkileri azaltabilmektedirler (65).

TLR2’nin ekstraselüler parçasına karşı oluşan antikorların, TLR2 ligandları ile karşılaşmış farelerde mortaliteyi azaltabildiği gösterilmiştir (99). Bu antikorlardan T2.5, lipoteikoik asidin TLR2’ye bağlamasına engel olur. Bu bulgular, anti-TLR2 antikorlarının, TLR2 bağımlı septik olmayan inflamasyon ve organ disfonksiyonunda yararlı olabileceğini ortaya koymaktadır.

TLR2 veya TLR4 ilişkili intraselüler yolakların modülasyonunu hedef alan moleküler yaklaşımlar günümüzde araştırma aşamasındadır. Örneğin, sikloheksen türevi olan TAK-242, TLR4’ün küçük sentetik bir inhibitörüdür. TLR4’ün intraselüler parçasındaki Cys747 molekülüne bağlanarak bu inhibisyonu gerçekleştirir (100). TAK-242, TLR4 ilişkili TRIF yolağını ve MyD88 bağımlı yolağı inhibe eder (100). TRAM’in yeni bir varyantı olan TAG (TRAM adapter with gold domain), MyD88 bağımsız sinyal yolağını TRIF ve TRAM arasındaki ilişkiyi bozarak spesifik olarak inhibe eder (101).

TLR2/TLR6 heterodimerinin ve MD2 ile eşleşmiş TLR4 homodimerinin kristal yapısının ayrıntılı bir şekilde anlaşılması ile, mikrobiyal olmayan ligandların TLR2 ve TLR4’e nasıl bağlandıklarını açıklamak mümkün olmuştur. Bu dimerlerin mikrobiyal ve mikrobiyal olmayan ligandlar ile etkileşiminin tam anlaşılması ile TLR2 ve TLR4’ün aktivasyonu ve bu reseptörler yoluyla aşırı sinyal yolaklarının inhibisyonu ile ilgili yeni bakış açıları ortaya konmaktadır. Kristallografi ve ilişkili fonksiyonel çalışmalar, DAMPs ve diğer mikrobiyal olmayan TLR2 veya TLR4 ligandlar ile gerçekleşen hücresel aktivasyonun, konak savunma mekanizmalarını bozmadan nasıl düzenlenebileceği ile ilgili yeni yaklaşımlar sunmaktadır.

Bu derlemede bahsedilen ligandlar dışında, kritik hastalarda TLR2 ve TLR4 aracılı septik olmayan inflamasyona katkıda bulunabilen başka ligandlar da vardır. Örneğin, etanol ve asetaminofen ilişkili karaciğer hasarında, ventilatör ilişkili ve aspirasyon ilişkili akciğer hasarında ve hayatı tehdit eden astım alevlenmesinde de TLR2 ve TLR4’ün rol oynadığı bilinmektedir.

Sonuç

Bu derlemede tartışılan veriler, TLR2 ve TLR4’ün sadece bakteriyel enfeksiyonlar ile değil, aynı zamanda kritik hastalık patofizyolojisindeki mekanizmalarla da aktive olabileceğini göstermektedir. TLR2 ve TLR4’ün ROS ve enfeksiyon ile ilişkili olmayan diğer mekanizmalar ile aktive olması, enfeksiyöz nedenler ile ilişkili olan mekanizmalardan farklıdır. Ayrıca farklı gen aktivasyonları ve proinflamatuar mediatörlerin salıverilmesi söz konusudur. TLR2, TLR4 ve diğer TLR’ler ile enfeksiyöz olmayan mediatörler arasındaki ilişkiler ve bunların kritik hastalardaki patofizyolojik önemlerini anlamak için gelecekte yeni çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır.

TLR2 ve TLR4 yoluyla, ROS, hiyalüronik asit fragmanları, HMGB1 ve diğer enfeksiyöz olmayan mediatörlerin akut inflamatuar süreçler ve organ disfonksiyonuna katkıda bulunabilmesi, yoğun bakım hastalarındaki tedavi yaklaşımları için önemlidir. TLR2 veya TLR4 ile spesifik ligandlar arasında oluşan kompleksler veya TLR2 veya TLR4 ilişkili intraselüler sinyal mekanizmalarını hedef alan terapötik yaklaşımlar, sadece sepsiste değil, aynı zamanda travma, kanama gibi enfeksiyonun rol oynamadığı patofizyolojik durumlarda da yararlı olabilir. Gelecekte yapılacak olan yeni deneyler ve klinik çalışmalar bu hipotezlerin tedaviye yansıtılması için gereklidir.

Ya­zışma Ad­re­si/Ad­dress for Cor­res­pon­den­ce: Dr. Aycan Kundakcı, Başkent Üniversitesi Tıp Fakültesi, Anesteziyoloji Anabilim Dalı, Ankara, Türkiye
Tel.: +90 312 212 68 68-1919 GSM: +90 532 788 41 07 Faks: +90 312 212 15 83 E-pos­ta: [email protected]
Geliş Tarihi/Received: 26.07.2012